Электронный микроскоп что можно увидеть
Перейти к содержимому

Электронный микроскоп что можно увидеть

  • автор:

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия – один из методов исследования микроструктуры твердых тел, их электрических и магнитных полей, локального состава с применением совокупности электронно-зондовых методов. Данная технология была запатентована в 1931 году Р. Руденбергом, который создал первый в мире электронный микроскоп. Сегодня – это один из наиболее эффективных и передовых методов исследования, который широко используется на предприятиях, в научных, учебных лабораториях.

Метод электронной микроскопии

Данная технология стала основой в создании электронных микроскопов – приборов, в которых для построения изображения используется не световой луч, а поток электронов в вакуумной среде. Роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками.

Изображение передается на флюоресцирующий экран, где его можно сфотографировать и рассмотреть детально. К изучаемым объектам предъявляется ряд требований:

  1. Необходима предварительная фиксация и обработка. Объекты в процессе работы будут находиться в глубоком вакууме.
  2. Маленькая толщина. Поток электронов будет сильно поглощаться объектом. И большую толщину он не «пробьет». В качестве объектов используются срезы, толщиной от 20 до 50 нм. Для удобства работы их размещают на тонкие прозрачные пленки.
  3. Равномерность слоя. Перед началом исследования проводится механическая обработка. Она способна обеспечить постоянную толщину образца.

Разрешающая способность у электронных микроскопов значительно выше, чем у оптических. Величина 0,15 нм (15 А) позволяет получать увеличение в миллионы раз, что идеально подходит для изучения микроскопических объектов.

Основные особенности

Суть метода электронной микроскопии в том, что через исследуемый образец подается электронный пучок разной энергии. Под воздействием электромагнитного поля он фокусируется на поверхности в виде пятна, в диаметре не превышающего 5 нм. Это пятно и выполняет «изучение» объекта. Соприкасаясь с поверхностью, электронный пучок частично проникает в нее, вытесняя не только электроны, но и фотоны. Они попадают на лучевую трубку, где и из них и формируется изображение.

В сравнении со световыми (оптическими) микроскопами, электронные обладают преимуществами:

  1. Можно получать очень большое увеличение (вплоть до 300000) с сохранением высокого разрешения, вплоть до атомов. Такой результат достигается при прямом наблюдении объекта. То есть не требуется дополнительных увеличений.
  2. Позволяют изучать химический состав образца по точкам. Используется спектральный анализ рентгеновского излучения, которое возбуждается электромагнитным потоком.
  3. Пользователь получает прямую электронно-оптическую информацию об исследуемом объекте. При необходимости ее можно будет дополнить сопутствующими данными, основываясь на электронной дифракции электронов с веществом. Как пример: при помощи дифракционного контраста изображений определяются кристаллографические показатели.
  4. Обеспечивает возможность дополнительного воздействия на объект в ходе исследования. Его можно нагревать, облучать, деформировать, намагничивать. Наблюдение за процессами будет динамическим. Есть возможность фото- и видеофиксации происходящего. Качество изображения будет достаточно высоким.
  5. Есть возможность наблюдать за рельефом поверхности, анализируя катодолюминесценцию. Такую возможность предоставляет электронная растровая разновидность микроскопии.

Виды электронной микроскопии

Выделяют 2 основных вида электронной микроскопии:

  1. Просвечивающая или трансмиссионная – ПЭМ.
  2. Сканирующая или растровая – СЭМ.

Просвечивающая электронная микроскопия

В микроскопах, работающих по этой технологии на объект, воздействует пучок ускоренных электронов, обладающих энергией от 50 до 200 кэВ. Те электроны, которые образец не пропустит, будут отклоняться на небольшой угол. И они, и те, которые пройдут через исследуемый объект с незначительными энергетическими потерями, попадают на магнитные линзы. В результате на фотопленке или люминесцентном экране формируется изображение внутренней структуры. Хорошие результаты дает при исследовании ультратонких образцов – менее 0,1 мкм в толщину.

При работе с ПЭМ одна из наиболее важных задач – различать природу контрастов:

  • Абсорбционный. Результат неупругого рассеивания электронов, которые проходят через образец. Более плотные элементы будет выделяться темным на общем белом фоне. Если состав образца однородный, контрастировать будут участки разной толщины. Применяется при исследовании микрочастиц на аморфной пленке.
  • Дифракционный. Формируется при упругом рассеивании электронов, которые проходят через исследуемый образец на неподвижных и стандартно размещенных атомах кристаллической решетки. Подходит для определения кристаллической структуры и размеров решетки.
  • Амплитудный. Контраст такого типа образуется в результате выделения одного конкретного рефлекса из общей дифракционной картины. Его изображение передается на оптическую ось. При этом прямой пучок окажется на экране светлым, а тот, который отклонился (дифрагированный) – темным. Неоднородности укажут на дефекты кристаллической решетки. Применяется такой метод исследования для определения несовершенства кристаллической решетки, ее природы и свойств.
  • Фазовый. Образуется при многопучковой электронной дифракции как результат уменьшения или увеличения амплитуды волн с разным сдвигом по фазе. Позволяет определять ориентацию кристаллических решеток разных фаз образца, дефекты решеток.

Одна из разновидностей ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ). Формируется в случае, когда пучок электронов падает параллельно оси кристаллов в условиях фазового контраста. Позволяет диагностировать даже мельчайшие неоднородности кристаллической решетки.

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) получают изображения поверхности исследуемого образца с высокой разрешающей способностью. Получают трехмерные картинки, которые будут удобными в процессе изучения структуры. Дополнительно можно использовать методики EDX, WDX, чтобы получить информацию о химическом составе околоповерхностных слоев.

В оборудовании сфокусированный электронный пучок средней энергии сканирует образец. Предусмотрено несколько режимов работы:

  1. Режим отраженных электронов.
  2. Режим вторичных электронов.
  3. Режим катодолюминиценции и пр.

Эти методики позволяют не только изучать свойства поверхности, но и получать наглядную информацию о структурах, расположенных на несколько микрон ниже верхнего слоя.

СЭМ может работать только с образами, которые можно погружать в вакуум – твердыми. Жидкие среды предварительно подвергают криозаморозке. Форма и размеры образца ограничиваются только размерами рабочей камеры микроскопа. Эффективность исследования можно повысить путем напыления слоя токопроводящего материала.

Возможности

Технология электронной микроскопии постоянно развивается:

  1. совершенствуются способы подготовки образцов;
  2. разрабатываются методики для получения более качественной и широкой информации;
  3. улучшается электронная оптика;
  4. повышается чувствительность методов анализа применением спектрометрических систем;
  5. разрабатываются методики компьютерной обработки изображений с целью получения более широкой информации о структуре;
  6. тестируются методы компьютеризации, автоматизации путем подключения к микроскопу дополнительной аппаратуры и пр.

Благодаря последним наработкам метод электронной микроскопии используют уже и при работах с влажными образцами, исключая нарушение их структуры и локального состава. Для этого применяется низкотемпературное замещение воды, сверхбыстрое замораживание в среде хладагента, прижим к металлу, который охлаждается жидким азотом и пр. Существенно возможности метода расширило использование компьютерной техники, в частности математическая обработка электронных изображений. Теперь изображения можно запоминать, корректировать контрастность, добавлять оттенки цветов, выделять микроструктуры, убирать шумы, выделять границы исследуемых участков и пр.

Области применения

Метод электронной микроскопии используют для изучения поверхности объектов, ультратонких срезов тканей, микробов. С его помощью определяют строение жгутиков, вирусов и пр. Оборудование, основанное на этой технологии, широко используется в различных научных и производственных отраслях:

  1. Полупроводники, хранение данных. Выполняется анализ дефектов, трехмерная метрология, определяются неисправности, редактируются рабочие схемы.
  2. Биология и медицина. Электронные микроскопы применяют в криобиологии, электронной и клеточной томографии, вирусологии, стекловании. С их помощью определяют локализацию белков, анализируют частички, выполняют фармацевтический контроль качества, получают трехмерные изображения тканей.
  3. Промышленности. Электронные микроскопы позволяют снимать плоские и трехмерные микрохарактеристики, параметры частиц, проводить динамические эксперименты с материалами, получения изображения высокого разрешения. Они применяются в химической, нефтехимической горнодобывающей отрасли, микротехнологии, судебной медицине и пр.
  4. Научно-исследовательские лаборатории. Электронная микроскопия позволяет делать квалификацию материалов, создавать нанопрототипы, исследовать микроструктуры металлов, подбирать материалы и образцы. Микроскопы также применяются для тестирования и снятия характеристик.

Главная задача – подобрать микроскоп, работающий электронным методом под особенности предстоящих работ. В каталоге компании «Sernia Инжиниринг» можно подобрать подходящее оборудование для любой научно-исследовательской и производственной задачи. Приборы поставляются по Москве, Санкт-Петербургу и в другие регионы РФ. Все они имеют сертификаты соответствия, на них действуют гарантии. Узнать актуальные цены, условия сотрудничества, получить консультации и помощь в выборе можно у менеджеров компании. Свяжитесь с ними по телефону или через онлайн-форму.

А.С.Илюшин, А.П.Орешко. Введение в дифракционный структурный анализ. М.: физический факультет МГУ, 2008

Увидеть незримое и почувствовать неосязаемое. На что еще способен электронный микроскоп?

Ни для кого не секрет, что существуют вещи и организмы настолько маленькие, что увидеть их невооруженным глазом просто невозможно. Однако за последние сто лет наука шагнула далеко вперед. И теперь мы можем не только посмотреть на инфузорию, но и увидеть собственными глазами атомы, и даже, буквально, пощупать рельеф микроструктуры кристаллов. А все благодаря электронной микроскопии… Давайте разберемся, как такое возможно.

Перед вами небольшой обзор на электронные микроскопы и их возможности.

Изображение вируса Эбола, полученное при помощи просвечивающей электронной микроскопии

Несмотря на то, что «электронная микроскопия» звучит очень современно, запатентована она была еще в 1931 году германо-американским инженером и изобретателем Райнхольдом Руденбергом. Это был настоящий переворот в области изучения микроструктур.

В световом микроскопе, которым на тот момент пользовались исследователи, изображение давали световой луч и незамысловатая конструкция из оптических линз. В электронном микроскопе (ЭМ) роль луча выполнял поток электронов в вакууме, фокусируемый, словно линзами, электромагнитными катушками.
Изображение передавалось на флюоресцирующий экран, где его можно было детально рассмотреть. Данная технология позволила исследовать микроструктуры твердых тел, их локальный состав, а также электромагнитные поля.

▎В чем суть электронной микроскопии?

Как уже было сказано, на исследуемый объект подается пучок электронов, который фокусируется на образце при помощи электромагнитного поля. «Точка» фокусировки электронов имеет не более 5 нм в диаметре. Для сравнения, толщина волоса — 80 000 нм. При соприкосновении с объектом электроны частично проникают внутрь, вытесняя родные электроны и фотоны образца, которые, в свою очередь, попадают на лучевую трубку, где и формируется изображение.

▎Каковы преимущества электронной микроскопии?

  • Первое и основное отличие от светового микроскопа — увеличение. Профессиональный современный световой микроскоп может увеличить изображение в 2 тысячи раз. Электронный микроскоп дает увеличение до 300 тысяч при разрешающей способности 0,5 нм. На таком увеличении уже можно рассмотреть атомы.
  • Второе существенное преимущество — при помощи спектрального анализа рентгеновского излучения, возбуждаемого электромагнитным полем, можно изучить химический состав образца в конкретных точках.
  • В процессе можно воздействовать на исследуемый объект: облучать, нагревать, намагничивать или деформировать. И полученная картинка будет динамически изменяться.
  • Имеется возможность зафиксировать процессы на фото- или видеосъемку в высоком разрешении.
  • Исследователь получает электронно-оптическую информацию, которую можно дополнить данными, основанными на дифракции электронов с материалом исследуемого объекта. К примеру, определение показателей кристаллографии при использовании дифракционного контраста.
  • В растровой разновидности электронной микроскопии можно рассматривать рельеф поверхности объекта при помощи анализа катодолюминесценции.

▎А каковы недостатки?

⁣ ⁣ ⁣ ⁣ ⁣ ⁣А вот недостатков много:

  • Во-первых, в отличие от светового микроскопа, в котором образец можно просто поместить под окуляр, в ЭМ для работы необходим вакуум. Поэтому исследуемые образцы должны быть хорошо обработаны и зафиксированы. А потому невозможно исследовать живые объекты.
  • Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.
  • В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.
  • Из-за повышенной чувствительности и хрупкости ЭМ нужно размещать абсолютно неподвижно, на виброустойчивой колонне, в здании без внешних магнитных полей.
  • ЭМ создает исключительно черно-белые изображения.
  • И, конечно, стоимость. Далеко не каждый исследовательский центр может позволить себе ЭМ. Он дорог и при покупке, и в обслуживании.

  • Трансмиссионная или просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
  • Растровая или сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Нитчатая водоросоль в световом микроскопе (а), СЭМ (б) и ПЭМ (в)

Просвечивающий электронный микроскоп

ПЭМ похож на обычный световой микроскоп, но вместо луча света используется поток электронов, а длина волны намного меньше, чем фотонная. Поэтому изображения получаются в более высоком разрешении.

Вирус свиного гриппа в просвечивающим электронном микроскопе

Фокусировка электронного потока осуществляется при помощи электромагнитных и электростатических линз. Возникают даже присущие фотонным микроскопам хроматические аберрации. Только природа такого искажения абсолютно иная. Кроме того, за счет закручивания электронов вдоль оси пучка в линзе, возникают дополнительные искажения.

У ПЭМ очень высокое разрешение, что позволяет разглядеть атомы вещества и детально рассмотреть, к примеру, возбудителя вирусного заболевания. Собственно, с появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА), электронным микроскопом перестали активно пользоваться для определения вирусов. И дело опять в стоимости и трудоемкости..

Из недостатков: объект, помещаемый в ПЭМ, должен быть не толще 1 микрона, то есть как один слой волоса, разрезанного вдоль на 50 частей. А вторая проблема — размер. ПЭМ занимает целую комнату: высотой в человеческий рост и с блоком питания, размером со шкаф.

ㅤㅤㅤ Просвечивающий электронный микроскоп

Сканирующий электронный микроскоп

СЭМ позволяет получать изображение очень высокого разрешения. Узко сфокусированный луч электронов микрон за микроном сканирует поверхность изучаемого образца. СЭМ дает возможность, в том числе, получить трехмерное изображение. У данного типа микроскопов имеется большое количество датчиков, способных улавливать все вытесняемые электронами частицы: электроны, видимый инфракрасный и ультрафиолетовый спектры света, рентгеновское излучение.

В отличие от ПЭМ, работа которого похожа на работу оптического микроскопа, работа СЭМ напоминает устройство старого телевизора. В таких телевизорах есть электронно-лучевая трубка. По ней в вакууме проходят электроны, испускаемые электронной пушкой, и есть система корректирующих движение линз, которые могут фокусировать или отклонять электроны. В СЭМ все то же самое, только электронами обстреливают исследуемый объект, а не люминофоры экрана, а вся поступающая информация фиксируется различными детекторами..

ㅤㅤ Сканирующий электронный микроскоп

У СЭМ есть несколько принципиально разных режимов работы, которые зависят от детекторов.

Рассмотрим основные виды:

• Детектор вторичных электронов

Используется для определения морфологии поверхности образца, поскольку сигнал вторичных электронов высокочувствителен к рельефу, шероховатостям и неровностям. Чаще всего данный режим работы используется в биологии для определения пор, борозд и изломов, к примеру, при изучении бактериальной клетки.

Изображение пыльцы, полученное путем детектирования вторичных электронов

• Детектор обратно отраженных или обратно рассеянных электронов

Используется для определения состава разносоставного вещества со множеством включений, поскольку сигнал рассеянных электронов чувствителен к специальному композиционному контрасту. Таким образом, на получаемом изображении, вещества разного состава в одном объекте будут иметь разные оттенки серого. Данный режим применяется, в основном, в кристаллографии и биологии.

Морфология интерфейса между оксидной и металлической составляющими, сделанная в режиме детектирования отраженных электронов

• Энергодисперсионный спектрометр

Позволяет определить элементный состав веществ и включений исследуемого образца. Конечно, в большинстве случаев важнее определить химический, а не элементарный состав. Зато энергодисперсионный спектрометр позволяет точечно, для каждого микрокомпонента определить состав. Кроме того, для данного метода не требуется никаких реагентов. Используется в химии и кристаллографии.

Анализ элементного состава микрокомпонентов полированного образца анодного шлака с помощью энергодиспрсионного спектрометра

• Детектор прошедших электронов

Электроны, прошедшие тонкий срез образца насквозь, приходят к датчику под разным углом, что дает различную информацию об исследуемом объекте. Угол рассеивания зависит от толщины среза, материала образца и энергии первичного электронного пучка. Детектор передает псевдоцветное изображение, где каждый цвет соответствует своему сигналу.

Коррозия, распространяющаяся сквозь хромовое покрытие на стали. Изображение получено при помощи детектирования прошедших электронов.

• Детектор катодолюминесцентного излучения

Используется при изучении материалов, обладающих люминесценцией, то есть способные излучать видимый свет при попадании на них электронного потока.

Катодолюминесценция — это, по сути, способность вещества замещать оставленные после облучения электронами дырки, захватывая свободные электроны и выделяя световую энергию. Это свойственно для металлов: чистых и с примесями. Свет, производимый металлом с примесью, будет другого оттенка, что и будет фиксироваться детектором..

Изображение циркона, полученное
при детектировании катодолюминесцентного излучения

СЭМ может работать исключительно с твердыми образцами в вакууме. Поэтому для работы с жидкостями, их необходимо подвергнуть глубокой заморозке. Зато форма и размер образца могут быть любыми в пределах объема рабочей камеры. Продуктивность работы повышается при нанесении на исследуемый образец тонкого слоя токопроводящего материала.

Электронная микроскопия применяется во многих сферах науки и промышленности:

Биология и медицина

При помощи ЭМ можно осуществить томографию тканей, детально рассмотреть клетки, определить локализацию белков, увидеть вирус и даже выполнить фармацевтический контроль качества.

Физика, химия и кристаллография.

ЭМ позволяет изучить микроструктуры металлов и кристаллов вещества, классифицировать материалы, тестировать характеристики различных веществ, определять состав, поверхность и плотность объектов.

Полупроводники и хранение данных
С помощью ЭМ выявляются и редактируются неисправности систем, выполняется анализ дефектов.
Промышленность

ЭМ помогает определять параметры частиц и целых структур. Позволяет в динамике посмотреть на материалы в высоком разрешении. При необходимости дает возможность построения трехмерной модели микроструктуры.

В некоторых сферах электронная микроскопия незаменима. Поэтому исследователи постоянно работают над усовершенствованием методов и возможностей в данной области. Рассмотрим некоторые из них.

▎3D моделирование

В некоторых случаях, к примеру, в биологии и медицине, могут потребоваться не просто фотографии ультратонких срезов, а трехмерные изображения какой-либо ткани или организма.

Это возможно осуществить несколькими способами:

1. ПЭМ серийных срезов

Самый первый из подходов к трехмерному моделированию на электронном микроскопе. Способ заключается в создании ленты ультратонких срезов, которые собираются на специальной сетке, покрываемой углеродом и особым веществом — формваром. Полученные изображения обрабатываются в специальной программе: создается контур, фотографии выравниваются, обрезаются и сводятся в одно трехмерное изображение. Процесс сведения трудоемкий и занимает очень много времени, а размеры изображения ограничены. Еще одной проблемой являются существенные зазоры между слоями. Кроме того, ультратонкие срезы очень хрупкие и подвержены повреждениям. И чем их больше, тем выше шанс деформации образца.

2. Криоэлектронная томография

По сравнению с ПЭМ серийных срезов, позволяет увидеть в более высоком разрешении более мелкие структуры, величиной от 3 нм, к примеру, элементы цитоскелета. Однако образцы должны быть довольно мелкими (100—500 нм) поэтому КЭТ не применима для крупных объектов и подходит только для молекулярных комплексов, вирусов и мелких бактерий.

Принцип метода криоэлектронной томографии

В процессе КЭТ объект исследования постепенно поворачивается и изображения получаются под разным углом наклона. После этого все фотографии сводятся в одно 3D изображение. Минус метода в том, что образец получает высокую дозу излучения, за счет чего часть мелких деталей теряется в процессе исследования.

3. Многоэнергетическая деконволюция

При помощи этого метода можно получить несколько изображений образца на разной его глубине, не разрушая поверхности объекта. Такой эффект достигается за счет изменения ускоряющего напряжения электронов. И чем выше энергия, тем глубже в объект может проникнуть электрон. Каждое изображение будет давать характеристику определенного слоя. А специальный программный алгоритм соберет множество срезов в трехмерную модель с максимальным разрешением до 10 нм. Помимо прочего, данный метод можно использовать совместно с методом ультратонких срезов.

4. Фокусирующая ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (ФИЛ-СЭМ)

Суть метода заключается в параллельном «разрезании» исследуемого образца на слои пучком ионов галлия и сканировании объекта электронным пучком. Слой получается толщиной 5—10 нм. Полученные изображения собираются в единую трехмерную модель.

Раскрашенное изображение бактериофагов
(зеленые), поразивших кишечную палочку (голубые), сделанное в ФИЛ-СЭМ

Сложность метода в подготовке. Перед проведением операции необходимо защитить образец от части заряда. Для этого на сам объект, к примеру, кусок органа, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта — 100*100 мкм. Кроме того, метод очень долгий, а с увеличением глубины резки снижается качество.

Принцип метода ФИЛ-СЭМ

5. СЭМ с автоматизированной лентой для сбора срезов

По сути, это улучшенная версия метода серийных срезов. Специальная насадка на ультрамикротом, который делает срезы, работает автоматически и способна делать до 1000 срезов в день, помещая их на специальную ленту. Далее лента разрезается на фрагменты, кладется на подложку, срезы обрабатываются контрастом и углеродом, после чего разрезанный образец помещается в СЭМ. Полученные изображения имеют разрешение 5 нм.

Ультрамикротом со специальной насадкой и вставленной лентой для срезов

6. Последовательная сканирующая электронная микроскопия поверхности блока

Используется для получения трехмерной модели большого объекта. Для этого ультрамикротом помещается внутрь СЭМ. В процессе происходит последовательное срезание ультратонких слоев образца с последующим сканированием. Для улучшения изображения может использоваться контраст. Преимущество данного метода заключается в величине объекта и скорости обработки информации. За получаемыми данными можно наблюдать в реальном времени.

▎Цветное изображение

Большим минусом ЭМ является черно-белое изображение. Однако и с этим ученые смогли справиться.

Самый простой метод — коррелятивная свето-электронная микроскопия (КСЭМ). Для окрашивания изображения один и тот же объект фотографируется в световом и в электронном микроскопе, а затем программа соединяет два изображения. Однако из-за разницы в разрешении изображение лишь радужно подкрашивается согласно распределению флуоресцентного красителя. Выделить микроструктуры таким образом не удастся.

Коррелятивная свето-электронная микроскопия элементов цитоскелета

Ученые объединили КСЭМ с трехмерной световой микроскопией, уже известной нам ФИЛ-СЭМ и с микроскопией сверхвысокого разрешения (СР-микроскопия), которая позволяет получить большее разрешение за счет объединения на экране множества снимков.

Срез ядер нейронов при микроскопии сверхвысокого разрешения

Составив изначально изображение высокого разрешения, ученые резали образец лучами ионов. Изображение получало цвет за счет световой микроскопии структурированного освещения, позволяющего увеличить разрешение снимка в два раза за счет поочередной подсветки отдельных точек при фоновом свечении остального образца, и одномолекулярной световой микроскопии, при которой флуоресценция красителя активируется слабым лазером. Одномолекулярная микроскопия позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения свели вместе и получили полноценные цветные снимки. С помощью данной методики удалось разглядеть, к примеру, ультраструктуру нейронов.

Трехмерные модели ядер нейронов, полученные при коррелятивной микроскопии

Итак, электронный микроскоп — вещь, во многих сферах незаменимая. Ученые потихоньку нивелируют его минусы и решают проблемы, связанные с его использованием. Возможно, в скором времени, из минусов останутся только размер и стоимость. Хотя… Может, и это исправимо?

Автор: Соловьёва Софья, микробиолог.

Использованная литература:

  • Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Ф. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в двух книгах. Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. 303 с.
  • Уманский Я. С., Скаков Ю. А., Иванов А. Н., Расторгуев Л. Н… Кристаллография, рентгенография и электронная микроскопия. — М.: Металлургия, 1982, 632 с.
  • СиндоД. Оикава. Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. — М.: Техносфера, 2006, 256 с. ISBN 5-94836-064-4.
  • Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology, 2(11).
  • Efimov, A. E., Tonevitsky, A. G., Dittrich, M., & Matsko, N. B. (2007). Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: A novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy, 226(3), 207–217. doi.org/10.1111/j.1365-2818.2007.01773.x
  • Peddie, C. J., & Collinson, L. M. (2014). Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. Elsevier Ltd. doi.org/10.1016/j.micron.2014.01.009
  • Schalek, R., Kasthuri, N., Hayworth, K., Berger, D., Tapia, J., Morgan, J., … Lichtman, J. (2011). Development of High-Throughput, High-Resolution 3D Reconstruction of Large-Volume Biological Tissue Using Automated Tape Collection Ultramicrotomy and Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 17(S2), 966–967. doi.org/10.1017/S1431927611005708
  • Wagner, J., Schaffer, M., & Fernández-Busnadiego, R. (2017, September 1). Cryo-electron tomography—the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. Wiley Blackwell. doi.org/10.1002/1873-3468.12757

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП, прибор, который позволяет получать сильно увеличенное изображение объектов, используя для их освещения электроны. Электронный микроскоп (ЭМ) дает возможность видеть детали, слишком мелкие, чтобы их мог разрешить световой (оптический) микроскоп. ЭМ – один из важнейших приборов для фундаментальных научных исследований строения вещества, особенно в таких областях науки, как биология и физика твердого тела.

Также по теме:

Существуют три основных вида ЭМ. В 1930-х годах был изобретен обычный просвечивающий электронный микроскоп (ОПЭМ), в 1950-х годах – растровый (сканирующий) электронный микроскоп (РЭМ), а в 1980-х годах – растровый туннельный микроскоп (РТМ). Эти три вида микроскопов дополняют друг друга в исследованиях структур и материалов разных типов.

ОБЫЧНЫЙ ПРОСВЕЧИВАЮЩИЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП

ОПЭМ во многом подобен световому микроскопу см. МИКРОСКОП, но только для освещения образцов в нем используется не свет, а пучок электронов. В нем имеются электронный прожектор (см. ниже), ряд конденсорных линз, объективная линза и проекционная система, которая соответствует окуляру, но проецирует действительное изображение на люминесцентный экран или фотографическую пластинку. Источником электронов обычно служит нагреваемый катод из вольфрама или гексаборида лантана. Катод электрически изолирован от остальной части прибора, и электроны ускоряются сильным электрическим полем. Для создания такого поля катод поддерживают под потенциалом порядка -100 000 В относительно других электродов, фокусирующих электроны в узкий пучок. Эта часть прибора называется электронным прожектором (см. ЭЛЕКТРОННАЯ ПУШКА). Поскольку электроны сильно рассеиваются веществом, в колонне микроскопа, где движутся электроны, должен быть вакуум. Здесь поддерживается давление, не превышающее одной миллиардной атмосферного.

Электронная оптика.

Также по теме:
ЭЛЕКТРОННАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ

Электронное изображение формируется электрическими и магнитными полями примерно так же, как световое – оптическими линзами. Принцип действия магнитной линзы поясняется схемой (рис. 1). Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, действует как собирающая линза, фокусное расстояние которой можно изменять, изменяя ток. Поскольку оптическая сила такой линзы, т.е. способность фокусировать электроны, зависит от напряженности магнитного поля вблизи оси, для ее увеличения желательно сконцентрировать магнитное поле в минимально возможном объеме. Практически это достигается тем, что катушку почти полностью закрывают магнитной «броней» из специального никель-кобальтового сплава, оставляя лишь узкий зазор в ее внутренней части. Создаваемое таким образом магнитное поле может быть в 10–100 тыс. раз более сильным, чем магнитное поле Земли на земной поверхности.

Схема ОПЭМ представлена на рис. 2. Ряд конденсорных линз (показана лишь последняя) фокусирует электронный пучок на образце. Обычно первая из них создает неувеличенное изображение источника электронов, а последняя контролирует размер освещаемого участка на образце. Диафрагмой последней конденсорной линзы определяется ширина пучка в плоскости объекта. Образец помещается в магнитном поле объективной линзы с большой оптической силой – самой важной линзы ОПЭМ, которой определяется предельное возможное разрешение прибора. Аберрации объективной линзы ограничиваются ее диафрагмой так же, как это происходит в фотоаппарате или световом микроскопе. Объективная линза дает увеличенное изображение объекта (обычно с увеличением порядка 100); дополнительное увеличение, вносимое промежуточными и проекционной линзами, лежит в пределах величин от несколько меньшей 10 до несколько большей 1000. Таким образом, увеличение, которое можно получить в современных ОПЭМ, составляет от менее 1000 до ~1 000 000. (При увеличении в миллион раз грейпфрут вырастает до размеров Земли.) Исследуемый объект обычно помещают на очень мелкую сетку, вкладываемую в специальный держатель. Держатель можно механическим или электрическим способом плавно перемещать вверх-вниз и вправо-влево.

Изображение.

Контраст в ОПЭМ обусловлен рассеянием электронов при прохождении электронного пучка через образец. Если образец достаточно тонок, то доля рассеянных электронов невелика. При прохождении электронов через образец одни из них рассеиваются из-за столкновений с ядрами атомов образца, другие – из-за столкновений с электронами атомов, а третьи проходят, не претерпевая рассеяния. Степень рассеяния в какой-либо области образца зависит от толщины образца в этой области, его плотности и средней атомной массы (числа протонов) в данной точке. Электроны, выходящие из диафрагмы с угловым отклонением, превышающим некоторый предел, уже не могут вернуться в пучок, несущий изображение, а поэтому сильно рассеивающие участки повышенной плотности, увеличенной толщины, места расположения тяжелых атомов выглядят на изображении как темные зоны на светлом фоне. Такое изображение называется светлопольным, поскольку на нем окружающее поле светлее объекта. Но можно сделать так, чтобы электрическая отклоняющая система пропускала в диафрагму объектива только те или иные из рассеянных электронов. Тогда образец выглядит светлым на темном поле. Слабо рассеивающий объект часто бывает удобнее рассматривать в режиме темного поля.

Окончательное увеличенное электронное изображение преобразуется в видимое посредством люминесцентного экрана, который светится под действием электронной бомбардировки. Это изображение, обычно слабоконтрастное, как правило, рассматривают через бинокулярный световой микроскоп. При той же яркости такой микроскоп с увеличением 10 может создавать на сетчатке глаза изображение, в 10 раз более крупное, чем при наблюдении невооруженным глазом. Иногда для повышения яркости слабого изображения применяется люминофорный экран с электронно-оптическим преобразователем. В этом случае окончательное изображение может быть выведено на обычный телевизионный экран, что позволяет записать его на видеоленту. Видеозапись применяется для регистрации изображений, меняющихся во времени, например, в связи с протеканием химической реакции. Чаще всего окончательное изображение регистрируется на фотопленке или фотопластинке. Фотопластинка обычно позволяет получить более четкое изображение, чем наблюдаемое простым глазом или записанное на видеоленте, так как фотоматериалы, вообще говоря, более эффективно регистрируют электроны. Кроме того, на единице площади фотопленки может быть зарегистрировано в 100 раз больше сигналов, чем на единице площади видеоленты. Благодаря этому изображение, зарегистрированное на фотопленке, можно дополнительно увеличить примерно в 10 раз без потери четкости.

Разрешение.

Электронные пучки имеют свойства, аналогичные свойствам световых пучков. В частности, каждый электрон характеризуется определенной длиной волны. Разрешающая способность ЭМ определяется эффективной длиной волны электронов. Длина волны зависит от скорости электронов, а следовательно, от ускоряющего напряжения; чем больше ускоряющее напряжение, тем больше скорость электронов и тем меньше длина волны, а значит, выше разрешение. Столь значительное преимущество ЭМ в разрешающей способности объясняется тем, что длина волны электронов намного меньше длины волны света. Но поскольку электронные линзы не так хорошо фокусируют, как оптические (числовая апертура хорошей электронной линзы составляет всего лишь 0,09, тогда как для хорошего оптического объектива эта величина достигает 0,95), разрешение ЭМ равно 50–100 длинам волн электронов. Даже со столь слабыми линзами в электронном микроскопе можно получить предел разрешения ок. 0,17 нм, что позволяет различать отдельные атомы в кристаллах. Для достижения разрешения такого порядка необходима очень тщательная настройка прибора; в частности, требуются высокостабильные источники питания, а сам прибор (который может быть высотой ок. 2,5 м и иметь массу в несколько тонн) и его дополнительное оборудование требуют монтажа, исключающего вибрацию.

РАСТРОВЫЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП

РЭМ, ставший важнейшим прибором для научных исследований, служит хорошим дополнением ОПЭМ. В РЭМ применяются электронные линзы для фокусировки электронного пучка в пятно очень малых размеров. Можно отрегулировать РЭМ так, чтобы диаметр пятна в нем не превышал 0,2 нм, но, как правило, он составляет единицы или десятки нанометров. Это пятно непрерывно обегает некоторый участок образца аналогично лучу, обегающему экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, возникающий при бомбардировке объекта электронами пучка, используется для формирования изображения на экране телевизионного кинескопа или электронно-лучевой трубки (ЭЛТ), развертка которой синхронизирована с системой отклонения электронного пучка (рис. 3). Увеличение в данном случае понимается как отношение размера изображения на экране к размеру области, обегаемой пучком на образце. Это увеличение составляет от 10 до 10 млн.

Взаимодействие электронов сфокусированного пучка с атомами образца может приводить не только к их рассеянию, которое используется для получения изображения в ОПЭМ, но и к возбуждению рентгеновского излучения, испусканию видимого света и эмиссии вторичных электронов. Кроме того, поскольку в РЭМ перед образцом имеются только фокусирующие линзы, он позволяет исследовать «толстые» образцы.

Отражательный РЭМ.

Отражательный РЭМ предназначен для исследования массивных образцов. Поскольку контраст, возникающий при регистрации отраженных, т.е. обратно-рассеянных, и вторичных электронов, связан в основном с углом падения электронов на образец, на изображении выявляется поверхностная структура. (Интенсивность обратного рассеяния и глубина, на которой оно происходит, зависят от энергии электронов падающего пучка. Эмиссия вторичных электронов определяется, в основном составом поверхности и электропроводностью образца.) Оба эти сигнала несут информацию об общих характеристиках образца. Благодаря малой сходимости электронного пучка можно проводить наблюдения с гораздо большей глубиной резкости, чем при работе со световым микроскопом, и получать прекрасные объемные микрофотографии поверхностей с весьма развитым рельефом. Регистрируя рентгеновское излучение, испускаемое образцом, можно в дополнение к данным о рельефе получать информацию о химическом составе образца в поверхностном слое глубиной ~0,001 мм. О составе материала на поверхности можно судить и по измеренной энергии, с которой эмиттируются те или иные электроны.

Все сложности работы с РЭМ обусловлены, в основном, его системами регистрации и электронной визуализации. В приборе с полным комплексом детекторов, наряду со всеми функциями РЭМ, предусматривается рабочий режим электронно-зондового микроанализатора.

Растровый просвечивающий электронный микроскоп.

Растровый просвечивающий электронный микроскоп (РПЭМ) – это особый вид РЭМ. Он рассчитан на тонкие образцы, такие же, как и исследуемые в ОПЭМ. Схема РПЭМ отличается от схемы на рис. 3 только тем, что в ней нет детекторов, расположенных выше образца. Поскольку изображение формируется бегущим пучком (а не пучком, освещающим весь исследуемый участок образца), требуется высокоинтенсивный источник электронов, чтобы изображение можно было зарегистрировать за приемлемое время. В РПЭМ высокого разрешения используются автоэлектронные эмиттеры высокой яркости. В таком источнике электронов создается очень сильное электрическое поле (ок. В/см) вблизи поверхности заостренной травлением вольфрамовой проволочки очень малого диаметра. Это поле буквально вытягивает миллиарды электронов из проволочки без всякого нагрева. Яркость такого источника почти в 10 000 раз больше, чем источника с нагреваемой вольфрамовой проволокой (см. выше), а испускаемые им электроны могут быть сфокусированы в пучок диаметром менее 1 нм. Были даже получены пучки, диаметр которых близок к 0,2 нм.

Автоэлектронные источники могут работать только в условиях сверхвысокого вакуума (при давлениях ниже Па), в которых полностью отсутствуют такие загрязнения, как пары углеводородов и воды, и становится возможным получение изображений с высоким разрешением. Благодаря таким сверхчистым условиям можно исследовать процессы и явления, недоступные ЭМ с обычными вакуумными системами.

Исследования в РПЭМ проводятся на сверхтонких образцах. Электроны проходят сквозь такие образцы почти без рассеяния. Электроны, рассеянные на углы более нескольких градусов без замедления, регистрируются, попадая на кольцевой электрод, расположенный под образцом (рис. 3). Сигнал, снимаемый с этого электрода, сильно зависит от атомного номера атомов в той области, через которую проходят электроны, – более тяжелые атомы рассеивают больше электронов в направлении детектора, чем легкие. Если электронный пучок сфокусирован в точку диаметром менее 0,5 нм, то можно получить изображение отдельных атомов. Реально удается различать на изображении, полученном в РПЭМ, отдельные атомы с атомной массой железа (т.е. 26 и более).

Электроны, не претерпевшие рассеяния в образце, а также электроны, замедлившиеся в результате взаимодействия с образцом, проходят в отверстие кольцевого детектора. Энергетический анализатор, расположенный под этим детектором, позволяет отделить первые от вторых. Измеряя энергию, потерянную электронами при рассеянии, можно получить важную информацию об образце. Потери энергии, связанные с возбуждением рентгеновского излучения или выбиванием вторичных электронов из образца, позволяют судить о химических свойствах вещества в области, через которую проходит электронный пучок.

РАСТРОВЫЙ ТУННЕЛЬНЫЙ МИКРОСКОП

В ЭМ, рассмотренных выше, для фокусировки электронов применяются магнитные линзы. Данный раздел посвящен ЭМ без линз. Но, прежде чем переходить к растровому туннельному микроскопу (РТМ), будет полезно кратко остановиться на двух старых видах безлинзового микроскопа, в которых формируется проецированное теневое изображение.

Автоэлектронный и автоионный проекторы.

Автоэлектронный источник, применяемый в РПЭМ, с начала 1950-х годов применялся в теневых проекторах. В автоэлектронном проекторе электроны, испускаемые за счет автоэлектронной эмиссии острием очень малого диаметра, ускоряются в направлении люминесцентного экрана, расположенного на расстоянии нескольких сантиметров от острия. В результате на экране возникает проецированное изображение поверхности острия и находящихся на этой поверхности частиц с увеличением, равным отношению радиуса экрана к радиусу острия (порядка ). Более высокое разрешение достигается в автоионном проекторе, в котором проецирование изображения осуществляется ионами гелия (или некоторых других элементов), эффективная длина волны которых меньше, чем у электронов. Это позволяет получать изображения, показывающие истинное расположение атомов в кристаллической решетке материала острия. Поэтому автоионные проекторы используются, в частности, для исследования кристаллической структуры и ее дефектов в материалах, из которых могут быть изготовлены такие острия.

Растровый туннельный микроскоп (РТМ).

В этом микроскопе тоже используется металлическое острие малого диаметра, являющееся источником электронов. В зазоре между острием и поверхностью образца создается электрическое поле. Число электронов, вытягиваемых полем из острия в единицу времени (ток туннелирования), зависит от расстояния между острием и поверхностью образца (на практике это расстояние меньше 1 нм). При перемещении острия вдоль поверхности ток модулируется. Это позволяет получить изображение, связанное с рельефом поверхности образца. Если острие заканчивается одиночным атомом, то можно сформировать изображение поверхности, проходя атом за атомом.

РТМ может работать только при условии, что расстояние от острия до поверхности постоянно, а острие можно перемещать с точностью до атомных размеров. Вибрации подавляются благодаря жесткой конструкции и малым размерам микроскопа (не более кулака), а также применению многослойных резиновых амортизаторов. Высокую точность обеспечивают пьезоэлектрические материалы, которые удлиняются и сокращаются под действием внешнего электрического поля. Подавая напряжение порядка 10 –5 В, можно изменять размеры таких материалов на 0,1 нм и менее. Это дает возможность, закрепив острие на элементе из пьезоэлектрического материала, перемещать его в трех взаимно перпендикулярных направлениях с точностью порядка атомных размеров.

ТЕХНИКА ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Вряд ли остался какой-либо сектор исследований в области биологии и материаловедения, где бы не применялась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ); это обеспечено успехами техники приготовления образцов.

Все применяемые в электронной микроскопии методики нацелены на получение предельно тонкого образца и обеспечение максимального контраста между ним и подложкой, которая необходима ему в качестве опоры. Основная методика рассчитана на образцы толщиной 2–200 нм, поддерживаемые тонкими пластмассовыми или углеродными пленками, которые кладутся на сетку с размером ячейки ок. 0,05 мм. (Подходящий образец, каким бы способом он ни был получен, обрабатывается так, чтобы увеличить интенсивность рассеяния электронов на исследуемом объекте.) Если контраст достаточно велик, то глаз наблюдателя может без напряжения различить детали, находящиеся на расстоянии 0,1–0,2 мм друг от друга. Следовательно, для того, чтобы на изображении, создаваемом электронным микроскопом, были различимы детали, разделенные на образце расстоянием в 1 нм, необходимо полное увеличение порядка 100–200 тыс. Лучшие из микроскопов могут создать на фотопластинке изображение образца с таким увеличением, но при этом изображается слишком малый участок. Обычно делают микроснимок с меньшим увеличением, а затем увеличивают его фотографически. Фотопластинка разрешает на длине 10 см ок. 10 000 линий. Если каждая линия соответствует на образце некой структуре протяженностью 0,5 нм, то для регистрации такой структуры необходимо увеличение не менее 20 000, тогда как при помощи РЭМ и РПЭМ, в которых изображение регистрируется электронной системой и развертывается на телевизионном экране, может быть разрешено только ок. 1000 линий. Таким образом, при использовании телевизионного монитора минимально необходимое увеличение примерно в 10 раз больше, чем при фоторегистрации.

Биологические препараты.

Электронная микроскопия широко применяется в биологических и медицинских исследованиях. Разработаны методики фиксации, заливки и получения тонких срезов тканей для исследования в ОПЭМ и РПЭМ и методики фиксации для исследования объемных образцов в РЭМ. Эти методики дают возможность исследовать организацию клеток на макромолекулярном уровне. Электронная микроскопия выявила компоненты клетки и детали строения мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и множества других органелл, входящих в состав клетки. Образец сначала фиксируют глутаральдегидом или другими фиксирующими веществами, а затем обезвоживают и заливают пластмассой. Методы криофиксации (фиксации при очень низких – криогенных – температурах) позволяют сохранить структуру и состав без использования химических фиксирующих веществ. Кроме того, криогенные методы позволяют получать изображения замороженных биологических образцов без их обезвоживания. При помощи ультрамикротомов с лезвиями из полированного алмаза или сколотого стекла можно делать срезы тканей толщиной 30–40 нм. Смонтированные гистологические препараты могут быть окрашены соединениями тяжелых металлов (свинца, осмия, золота, вольфрама, урана) для усиления контраста отдельных компонентов или структур.

 IGDA МИКРОФОТОГРАФИЯ кристаллов холестерина в поляризованном свете.

Биологические исследования были распространены на микроорганизмы, особенно на вирусы, которые не разрешаются световыми микроскопами. ПЭМ позволила выявить, например, структуры бактериофагов и расположение субъединиц в белковых оболочках вирусов. Кроме того, методами позитивного и негативного окрашивания удалось выявить структуру с субъединицами в ряде других важных биологических микроструктур. Методы усиления контраста нуклеиновых кислот позволили наблюдать одно- и двунитные ДНК. Эти длинные линейные молекулы распластывают в слой основного белка и накладывают на тонкую пленку. Затем на образец вакуумным напылением наносят очень тонкий слой тяжелого металла. Этот слой тяжелого металла «оттеняет» образец, благодаря чему последний при наблюдении в ОПЭМ или РПЭМ выглядит как бы освещенным с той стороны, с которой напылялся металл. Если же вращать образец во время напыления, то металл накапливается вокруг частиц со всех сторон равномерно (как снежный ком).

Небиологические материалы.

ПЭМ применяется в исследованиях материалов для изучения тонких кристаллов и границ между разными материалами. Чтобы получить изображение границы раздела с большим разрешением, образец заливают пластмассой, делают срез образца, перпендикулярный границе, а затем утоньшают его так, чтобы граница была видна на заостренной кромке. Кристаллическая решетка сильно рассеивает электроны в определенных направлениях, давая дифракционную картину. Изображение кристаллического образца в значительной мере определяется этой картиной; контраст сильно зависит от ориентации, толщины и совершенства кристаллической решетки. Изменения контраста на изображении позволяют изучать кристаллическую решетку и ее несовершенства в масштабе атомных размеров. Получаемая при этом информация дополняет ту, которую дает рентгенографический анализ объемных образцов, так как ЭМ дает возможность непосредственно видеть во всех деталях дислокации, дефекты упаковки и границы зерен. Кроме того, в ЭМ можно снимать электронограммы и наблюдать картины дифракции от выделенных участков образца. Если диафрагму объектива настроить так, чтобы через нее проходили только один дифрагированный и нерассеянный центральный пучки, то можно получать изображение определенной системы кристаллических плоскостей, которая дает этот дифрагированный пучок. Современные приборы позволяют разрешать периоды решетки величиной 0,1 нм. Исследовать кристаллы можно также методом темнопольного изображения, при котором перекрывают центральный пучок, так что изображение формируется одним или несколькими дифрагированными пучками. Все эти методы дали важную информацию о структуре очень многих материалов и существенно прояснили физику кристаллов и их свойства. Например, анализ ПЭМ-изображений кристаллической решетки тонких малоразмерных квазикристаллов в сочетании с анализом их электронограмм позволил в 1985 открыть материалы с симметрией пятого порядка.

Высоковольтная микроскопия.

В настоящее время промышленность выпускает высоковольтные варианты ОПЭМ и РПЭМ с ускоряющим напряжением от 300 до 400 кВ. Такие микроскопы имеют более высокую проникающую способность, чем у низковольтных приборов, причем почти не уступают в этом отношении микроскопам с напряжением 1 млн. вольт, которые строились в прошлом. Современные высоковольтные микроскопы достаточно компактны и могут быть установлены в обычном лабораторном помещении. Их повышенная проникающая способность оказывается очень ценным свойством при исследовании дефектов в более толстых кристаллах, особенно таких, из которых невозможно сделать тонкие образцы. В биологии их высокая проникающая способность дает возможность исследовать целые клетки, не разрезая их. Кроме того, с помощью таких микроскопов можно получать объемные изображения толстых объектов.

Низковольтная микроскопия.

Выпускаются также РЭМ с ускоряющим напряжением, составляющим всего несколько сот вольт. Даже при столь низких напряжениях длина волны электронов меньше 0,1 нм, так что пространственное разрешение и здесь ограничивается аберрациями магнитных линз. Однако, поскольку электроны с такой низкой энергией проникают неглубоко под поверхность образца, почти все электроны, участвующие в формировании изображения, приходят из области, расположенной очень близко к поверхности, благодаря чему повышается разрешение поверхностного рельефа. С помощью низковольтных РЭМ были получены изображения на твердых поверхностях объектов размером менее 1 нм.

Радиационное повреждение.

Поскольку электроны представляют собой ионизирующее излучение, образец в ЭМ постоянно подвергается его воздействию. (В результате этого воздействия возникают вторичные электроны, используемые в РЭМ.) Следовательно, образцы всегда подвергаются радиационному повреждению. Типичная доза излучения, поглощаемая тонким образцом за время регистрации микрофотографии в ОПЭМ, примерно соответствует энергии, которой было бы достаточно для полного испарения холодной воды из пруда глубиной 4 м с площадью поверхности 1 га. Чтобы уменьшить радиационное повреждение образца, необходимо использовать различные методы его подготовки: окрашивание, заливку, замораживание. Кроме того, можно регистрировать изображение при дозах электронов, в 100–1000 раз меньших, нежели по стандартной методике, а затем улучшать его методами компьютерной обработки изображений.

ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА

История создания электронного микроскопа – замечательный пример того, как самостоятельно развивающиеся области науки и техники могут, обмениваясь полученной информацией и объединяя усилия, создавать новый мощный инструмент научных исследований. Вершиной классической физики была теория электромагнитного поля, которая объяснила распространение света, возникновение электрических и магнитных полей, движение заряженных частиц в этих полях как распространение электромагнитных волн. Волновая оптика сделала понятными явление дифракции, механизм формирования изображения и игру факторов, определяющих разрешение, в световом микроскопе. Успехам в области теоретической и экспериментальной физики мы обязаны открытием электрона с его специфическими свойствами. Эти отдельные и, казалось бы, независимые пути развития привели к созданию основ электронной оптики, одним из важнейших приложений которой являлось изобретение ЭМ в 1930-х годах. Прямым намеком на такую возможность можно считать гипотезу о волновой природы электрона, выдвинутую в 1924 Луи де Бройлем и экспериментально подтвержденную в 1927 К.Дэвиссоном и Л.Джермером в США и Дж.Томсоном в Англии. Тем самым была подсказана аналогия, позволившая построить ЭМ по законам волновой оптики. Х.Буш обнаружил, что с помощью электрических и магнитных полей можно формировать электронные изображения. В первые два десятилетия 20 в. были созданы и необходимые технические предпосылки. Промышленные лаборатории, работавшие над электронно-лучевым осциллографом, дали вакуумную технику, стабильные источники высокого напряжения и тока, хорошие электронные эмиттеры.

В 1931 Р.Руденберг подал патентную заявку на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 М.Кнолль и Э.Руска построили первый такой микроскоп, применив магнитные линзы для фокусировки электронов. Этот прибор был предшественником современного ОПЭМ. (Руска был вознагражден за свои труды тем, что стал лауреатом Нобелевской премии по физике за 1986.) В 1938 Руска и Б. фон Боррис построили прототип промышленного ОПЭМ для фирмы «Сименс-Хальске» в Германии; этот прибор в конце концов позволил достичь разрешения 100 нм. Несколькими годами позднее А.Пребус и Дж.Хиллер построили первый ОПЭМ высокого разрешения в Торонтском университете (Канада).

Широкие возможности ОПЭМ почти сразу же стали очевидны. Его промышленное производство было начато одновременно фирмой «Сименс-Хальске» в Германии и корпорацией RCA в США. В конце 1940-х годов такие приборы стали выпускать и другие компании.

РЭМ в его нынешней форме был изобретен в 1952 Чарльзом Отли. Правда, предварительные варианты такого устройства были построены Кноллем в Германии в 1930-х годах и Зворыкиным с сотрудниками в корпорации RCA в 1940-х годах, но лишь прибор Отли смог послужить основой для ряда технических усовершенствований, завершившихся внедрением в производство промышленного варианта РЭМ в середине 1960-х годов. Круг потребителей такого довольно простого в обращении прибора с объемным изображением и электронным выходным сигналом расширился с быстротой взрыва. В настоящее время насчитывается добрый десяток промышленных изготовителей РЭМ’ов на трех континентах и десятки тысяч таких приборов, используемых в лабораториях всего мира. В 1960-х годах разрабатывались сверхвысоковольтные микроскопы для исследования более толстых образцов. Лидером этого направления разработок был Г.Дюпуи во Франции, где в 1970 был введен в действие прибор с ускоряющим напряжением, равным 3,5 млн. вольт. РТМ был изобретен Г.Биннигом и Г.Рорером в 1979 в Цюрихе. Этот весьма простой по устройству прибор обеспечивает атомное разрешение поверхностей. За свою работу по созданию РТМ Бинниг и Рорер (одновременно с Руской) получили Нобелевскую премию по физике. См. также КРИСТАЛЛЫ И КРИСТАЛЛОГРАФИЯ; МОЛЕКУЛ СТРОЕНИЕ; НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ; ФИЗИКА ТВЕРДОГО ТЕЛА; ВИРУСЫ.

Световая и электронная микроскопия

Микроскоп — устройство, которое позволяет видеть увеличенное изображение объектов и структур, которые не видны глазу человека. В медико-биологических исследованиях используются световые и электронные методы микроскопии. Микроскопы, основанные на световой технологии, позволяют увеличивать объекты от 0.5 микрометров с разрешением объектов до 0.1 микрометра больше чем в 1500 раз. Микроскопы, основанные на электронной технологии — до 20 000 раз.
Технология световой микроскопии базируется на фундаментальных законах оптики, а так же на волновой теории в образовании изображений. Для освещения используют естественный, либо искусственный источники света. Первые простые микроскопы появились еще в 17-м веке. Более высоких успехов в их разработке смог добиться ученый из Голландии, А. Левенгук. В период с 1609 по 1610 гг. Г. Галилеем был построен более сложный микроскоп. В 1846 г. немецкий инженер-механик К. Цейсе открыл свою мастерскую и, примерно через год, начал изготавливать микроскопы. Цейс в своей фирме успешно использовал научные открытия профессора по физике Эрнста Аббе, который позже становится полноправным компаньоном Цейса. Теоретические и практические работы Э. Аббе, О. Шотта и А. Келера определили направления в развитии и принципы строения оптических систем в современных микроскопах.

Электронная микроскопия

электронная микроскопия, электронный микроскоп

Технология электронной микроскопии позволяет получать электронно-оптическое изображение при помощи потока электронов. Построение изображений базируется на фундаментальных законах волновой и геометрической оптики, а так же теории электромагнитного поля. Технология электронной микроскопии дает возможности для исследования объектов, у которых размеры лежат за пределами разрешающих возможностей светового микроскопа, а именно – объекты, менее 0.2 микрометров, и находит свое применение в изучении вирусов, бактериофагов, тонкого клеточного строения и других микрообъектов. Также такие микроскопы с успехом применяются для изучения макромолекулярных структур.
Очень важно не путать электронный микроскоп и цифровой микроскоп. В последнее время многие ошибочно называют цифровые usb микроскопы – электронными микроскопами. На самом же деле, это не так. Микроскоп с электронной технологией появился в конце 30-х годов. Серийным запуском электронных микроскопов занялась фирма немецкого происхождения «SIEMENS». В 1940 году в ГОИ имени С. И. Вавилова, находящимся в Ленинграде, создали первый отечественный микроскоп с электронной технологией, увеличительные способности которого достигали 10000 крат. Микроскопы с электронной технологией используются, в основном, в научно-исследовательских лабораторных комплексах, для серьезных научных разработок. Минимальная стоимость таких изделий начинается примерно с двух-трех миллионов рублей.

Для изучения окружающего мира юным натуралистам и биологам может понадобиться микроскоп. Он должен быть простым в применении, давать достаточное увеличение и четкое изображение исследуемого объекта.

Один из самых любопытных образцов в наборах, которыми часто комплектуются микроскопы — флакон с артемиями.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *